科研 | 山东大学：虾感染白斑综合症病毒后的肠道代谢谱和代谢产物亚油酸的抗病毒功能（国人佳作）

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编译：微科盟红烧大肥鸥，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读
白斑综合征病毒(WSSV)是一种危害对虾养殖的病原病毒，目前尚无有效的防治策略。肠道菌群及其代谢产物对对虾抵抗致病性致命病毒具有重要意义。然而，对虾感染WSSV后肠道代谢产物的变化尚不清楚。本研究建立了对虾人工感染WSSV的方法，并用高效液相色谱和串联质谱法分析了对虾肠道内容物中的代谢物。本研究共鉴定出78种不同的代谢物和5种不同的代谢途径，其中，我们发现不饱和脂肪酸亚油酸的含量在WSSV感染后显著增加，表明亚油酸可能参与了对虾的抗病毒免疫。进一步研究表明，口服亚油酸后，对虾的WSSV增殖明显降低，成活率显著提高。力学分析表明，亚油酸直接与WSSV病毒粒子结合，抑制病毒复制。亚油酸还通过激活ERK、NF-kB信号通路，促进抗菌肽和干扰素样基因Vago5的表达。结果表明，对虾感染WSSV后，肠道微生物区系发生代谢变化，代谢产物亚油酸参与了对虾对WSSV的免疫应答。

论文ID

原名：Metabolomic Profiles in the Intestine of Shrimp Infected by White Spot Syndrome Virus and Antiviral Function of the Metabolite Linoleic Acid in Shrimp译名：虾感染白斑综合症病毒后的肠道代谢谱和代谢产物亚油酸的抗病毒功能
期刊：Journal of immunology
IF：4.886发表时间：2021.05通讯作者：王金星
通讯作者单位：山东大学

实验设计

实验结果

1. 对虾可以通过口服WSSV疫苗感染
我们首先用不同拷贝的WSSV感染对虾，证实对虾可以通过口服感染WSSV，然后通过分析WSSV的囊膜蛋白Vp28和病毒拷贝在感染后对虾肠道中的表达情况来检测对虾的感染效率(表1)。通过对Vp28表达和WSSV拷贝的检测，我们发现口服1107个病毒粒子成功地感染了对虾。WSSV感染后24小时，Vp28在mRNA(图1A)和蛋白水平(图1B)的表达显著增加。对虾肠道中的病毒拷贝数显著增加(图1C)。这些结果表明，WSSV可以通过口服1×10⁷个病毒粒子成功地感染对虾。接下来，我们将1×10⁷份WSSV用于随后的虾感染。        图1 对虾WSSV口服感染方法的建立
（A）通过RT-PCR检测WSSV口服给药在虾肠中Vp28表达。β-肌动蛋白作为参考。（B）通过蛋白质印迹分析虾肠道中VP28的表达。ACTB（β-肌动蛋白）用作加载参考。（C）通过qPCR检测虾肠道中的病毒复制。** p <0.01，*** p <0.001。
表1 本研究中使用的引物序列A.退火温度(℃)；B.扩增子大小(Bp)；C.全长编码区扩增比例(%)。
2. 代谢物的多元统计分析
通过非靶向HPLC-MS/MS代谢组学方法分析了两组虾的肠道内容物，以确定感染了WSSV的虾与对照组之间肠道微生物代谢产物的差异。我们对收集的样本进行了多元统计分析，以测试所获取样本数据的可靠性。PCA的结果表明两组之间的差异[R2X（累积）> 0.5（图2A）]。PLS-DA和OPLS-DA显示两组样品可以很好地分离并且没有重叠，这表明两组的代谢物是不同的（图2B，2C）。这些结果表明，WSSV感染后虾的肠道代谢产物发生了显著变化。我们根据从OPLS-DA模型和来自归一化峰面积的双尾student-t检验的OPLS-DA模型和p值获得投影值的变量重要性（VIP）来选择差异性肠道代谢物，并且将差异肠道代谢物定义为22658代谢物中VIP值大于1.0且p小于0.05的代谢物（图2D）。本研究从22658个代谢物中鉴定了总共78种差异丰富的代谢物。其中，被WSSV感染后虾的肠道中有62种代谢物（包括亚油酸）增加，而被WSSV感染的虾中包括植酸的16种代谢物减少了（图3，表2）。图2 多变量统计分析和代谢物统计曲线图
(A)用SIMCA软件进行PCA评分。椭圆，PBS；三角形，WSSV。R2X(CUM)的参数为0.519。(B) PLS-DA计分图。R2Y(CUM)的参数为0.949。(C)OPLS-DA计分图。(D)使用火山地图显示所有检测到的小分子代谢物。深灰点代表WSSV喂食后与PBS组相比含量增加的代谢物。黑点代表WSSV喂食后与PBS组相比含量降低的代谢物，浅灰色点代表的代谢物与PBS组无差异。筛选标准为p值<0.05，VIP>1。
图3 WSSV感染和对虾的肠道菌群代谢产物的热图
每列代表一种代谢物，每组样品均重复六次。图例中不同的颜色强度表明不同代谢物的变化幅度。 表2 HPLC-MS/MS检测对虾肠道中的差异代谢物^a 保留时间(分钟)。^b WSSV感染后代谢物的变化。“+”表示平均值增加；“—”表示平均值减少。
3. 代谢途径富集
本研究通过代谢途径的KEGG途径富集分析获得代谢途径，并探讨了WSSV感染后肠道代谢途径改变的机制。结果表明，WSSV感染后虾肠道中的代谢途径发生了变化。20种不同的代谢产物可以在12种不同的代谢途径中富集（图4A，4B；表III）。我们以p <0.05为筛选显著差异的标准，结果显示WSSV感染后，甘油磷脂代谢，GPI锚生物合成，自噬-其他，自噬动物和不饱和脂肪酸的生物合成发生了显著变化（图4A，4B）。我们还发现不饱和脂肪酸亚油酸发生在不饱和脂肪酸的生物合成中（表3），并且在WSSV感染后亚油酸含量显着增加（图3）。图4 代谢途径富集图
（A）直方图用于显示通过每个代谢途径的KEGG途径富集分析获得的p值。每个代谢途径的log10（p值）用作纵坐标。灰色虚线的p值是0.01，而黑色虚线的p值是0.05。（B）气泡图用于显示通过KEGG途径富集分析获得的p值以及每个代谢途径中所含差异代谢物的数量。图标的大小表示这些途径中包含的差异代谢物的数量。密度代表该途径的p值。
表3 差异代谢物途径富集结果4. 亚油酸抑制虾中WSSV复制
先前的研究表明，肠道微生物产生的亚油酸可以预防肠道细菌感染，促进小鼠肠道菌群平衡。亚油酸还可以抑制杜氏利什曼原虫来源的微囊的释放，并降低其在巨噬细胞中的存活率。亚油酸与SARS-CoV-2的突触蛋白相互作用，抑制病毒感染。然而，亚油酸是否与对虾感染WSSV有关尚不清楚。因此，我们以编码WSSV囊膜蛋白的Vp28为指示剂，检测了口服亚油酸和感染WSSV后对虾体内WSSV的增殖情况。对虾在口服亚油酸后2h感染WSSV，并在感染WSSV后24h从对虾的血细胞和肠道中提取蛋白质和RNA(图5A、5B)。结果表明，对虾血细胞和肠道中Vp28mRNA的表达水平随剂量的增加而降低(图5C，5D)。我们用Western blotting检测Vp28蛋白的表达，得到相同的结果(图5E，5F)。此外，我们还检测了对虾体内的病毒拷贝，结果表明，在不同剂量的亚油酸(图5G)中投喂后，对虾肠道中的WSSV复制呈剂量依赖性地下降(图5G)。这些结果表明，亚油酸能够抑制对虾体内WSSV的增殖。图5 亚油酸抑制虾中WSSV的增殖
A）亚油酸的分子式和结构式的示意图。（B）示意图显示了亚油酸进食和WSSV感染的时间。用亚油酸喂养2小时后，口服WSSV（约1×10⁷病毒体），并在26小时后收集样品。（C）通过qPCR检测口服亚油酸，随后WSSV感染的虾的血细胞中Vp28的mRNA表达水平；经PBS注射WSSV感染的虾作为对照。（D）qPCR方法检测口服亚油酸后感染WSSV的对虾肠道中Vp28mRNA的表达水平，并以口服PBS的对虾为对照。（E）通过Western印迹检测虾的血细胞中Vp28的蛋白表达水平。（Ee）E组三个重复样品的统计分析。（F）通过蛋白质印迹法检测虾肠中VP28的蛋白表达水平。（Ff）统计分析是基于三个重复的数据。（G）喂食不同剂量的亚油酸后再感染WSSV的虾的病毒拷贝的统计分析。口服PBS的WSSV感染虾用作对照。（H）亚油酸提高了感染WSSV虾的成活率。虾分为两组。一组饲喂50μl的亚油酸，对照组饲喂相同剂量的PBS。2小时后，将两组用WSSV（约1×10⁷病毒体）口服感染，并计算两组的存活率。*p <0.05，**p <0.01。
5. 亚油酸提高了感染WSSV的虾的成活率
我们分析亚油酸对对虾感染WSSV后的存活率，以证实亚油酸的抗WSSV作用。结果表明，饲喂亚油酸的对虾存活率显著高于对照组(图5H)。这些结果表明，亚油酸可以可以提高虾的抗病毒免疫力。
6.亚油酸直接抑制WSSV在Sf9中的复制
为了检测亚油酸是否能直接影响WSSV的感染，由于目前尚无对虾细胞系，因此我们利用Sf9对WSSV的复制进行了检测。以前的研究表明，Sf9是研究WSSV(39)基因组复制、mRNA表达和病毒蛋白生产的一个很好的模型。为了选择合适的WSSV拷贝数感染Sf9，我们首先用不同拷贝数的WSSV感染Sf9。结果表明，不同拷贝数的WSSV均可感染Sf9(图6A、6B)，其中拷贝数为1×10⁸的WSSV感染效率较高(图6A)。接下来，我们使用1×10⁸个经亚油酸孵育的WSSV病毒颗粒，然后感染Sf9，以病毒的早期基因IE1和囊膜蛋白Vp28为指标检测WSSV的复制情况。结果表明，经亚油酸处理后，IE1和Vp28的表达显著降低(图6C，6D)。这些结果表明，亚油酸可以直接抑制WSSV在Sf9中的复制。图6 亚油酸抑制Sf9中Ie1和Vp28的表达
（A）通过半定量RT-PCR检测Sf9中Ie1表达。β-肌动蛋白用作参考。（B）通过蛋白质印迹分析了Sf9中的VP28表达。（C）通过qPCR检测Sf9细胞中Ie1和Vp28表达。β-肌动蛋白用作参考。（D）通过Western印迹分析VP28在Sf9细胞中的表达。（Dd）（D）的三个重复的统计分析。*p＜0.05。
7. 亚油酸通过激活NF-κB信号通路抑制WSSV感染
先前的研究表明，亚油酸可以激活NF-κB信号通路。另外，NF-κB途径可通过促进对虾中AP蛋白的表达来抵抗WSSV感染。为探讨亚油酸对对虾抗病毒作用的可能机制，检测了对虾感染WSSV亚油酸后肠道组织中NF-kB样转录因子背部和味觉的表达。结果表明，与对照组(PBS组和PBS+WSSV组)相比，饲喂亚油酸后DORSAL的表达显著增加(图7A)，尤其在肠道细胞核中(图7B)。同时，我们发现在饲喂亚油酸后，虾肠的细胞质和细胞核中RELISH的表达显着增加（图7C，7D）。为了进一步验证结果，我们使用了荧光免疫细胞化学法检测DORSAL和RELISH的核易位。我们发现，饲喂亚油酸后虾血细胞中NF-κB样转录因子的核转运明显增加（图8A，8B））。这些结果表明，亚油酸可以促进虾中DORSAL和RELISH的表达和核易位。此外我们检测到了几种AP的表达，结果表明虾的肠道中抗LPS因子（包括Alf-B1，Alf-C1，Alf-C2和Alf-D2）的表达显着增加。（图8C）。先前的研究发现，节肢动物中的一种类似IFN的基因Vago5参与了虾对WSSV感染的抗性。分析亚油酸是否可以促进Vago的表达在虾中，我们检测到口服亚油酸后虾中Vago5在mRNA和蛋白质水平上的表达。结果显示，在受到WSSV攻击的虾中，Vago5的表达显着增加（图8D，8E）。这些结果表明，亚油酸可以通过虾中的NF-κB途径促进Aps和IFN样基因Vago5的表达，从而抵抗WSSV感染。图7 WSSV感染后，亚油酸激活了NF-κB信号通路
（A）使用蛋白质印迹法检测亚油酸进食和WSSV感染后肠细胞中DORSAL的表达。（B）通过蛋白质印迹分析了亚油酸喂养和WSSV感染后虾的肠细胞核中DORSAL的表达。（C）亚油酸喂养和WSSV感染后，使用蛋白质印迹法检测RELISH在肠细胞中的表达。（D）通过蛋白质印迹分析了亚油酸喂养和WSSV感染后虾的肠细胞核中RELISH的表达。*p＜0.05。
图8 亚油酸激活了受到WSSV攻击的虾的ERK-NF-κB信号通路
（A）用亚油酸喂养后，对虾血细胞中DORSAL的核转位进行免疫细胞化学分析；PBS用作对照。比例尺，10 µm。（Aa）血细胞中DORSAL和细胞核共定位的统计分析。（B）用亚油酸喂养后，通过免疫细胞化学分析检测了虾血细胞中RELISH的核易位；PBS用作对照。比例尺，10 µm。（B b）RELISH和血细胞核共定位的统计分析。（C）的表达饲喂亚油酸后，在虾肠中检测到了mRNA的Aps。（D）亚油酸喂养后在虾的肠中检测到Vago5在mRNA水平上的表达。（E）使用蛋白质印迹法检测亚油酸喂养和WSSV感染后肠细胞中VAGO5的表达。（F）蛋白质印迹用于检测亚油酸进食和WSSV感染后肠细胞中ERK的磷酸化表达。（Ff）（F）的三个重复的统计分析。*p <0.05，**p <0.01。
8. WSSV感染后，亚油酸激活虾中ERK-NF-κB信号通路
NF-κB途径的激活受细胞激酶（例如ERKs）的调节。为了探索亚油酸如何激活AP表达的NF-κB信号，我们检测了亚油酸处理WSSV感染的虾后ERK的磷酸化。结果表明，被饲喂亚油酸并随后受到WSSV感染后，虾中ERK的磷酸化水平显着提高（图8F）。这些结果表明，亚油酸可以激活ERK-NF-κB信号通路，从而促进虾抗WSSV感染时Aps和Vago5的表达（图9）。图9 亚油酸鉴定及其在虾免疫中的抗WSSV功能的示意图
亚油酸鉴定示意图及其在对虾免疫中的抗WSSV功能。

讨论

肠是消化和吸收营养的重要器官，也是对虾易受WSSV感染的重要器官之一。肠道菌群在宿主的免疫系统中起着重要的调节作用，抵抗病原微生物的感染。在这项研究中，我们分析了感染WSSV的虾肠道菌群的代谢组，发现WSSV感染后代谢产物亚油酸（一种不饱和脂肪酸）显着增加。先前的研究表明，亚油酸可以改善小鼠的肠道健康和对细菌感染的免疫力。给草鱼饲喂亚油酸可以改变肠道形态并促进促炎细胞因子的表达。我们的研究发现，喂食亚油酸后WSSV VP28的表达显着下降，病毒的拷贝数也显着下降。此外，与对照相比，虾的成活率提高了，这些结果表明亚油酸可以提高虾的抗病毒免疫力。从饮食中获得的LCFA通过代谢成脂质代谢产物而积极参与免疫应答的调节，它们是能量和膜成分的来源。LCFAs可以通过共生细菌转化为具有生物活性的脂质代谢产物，并参与宿主免疫反应的调节。某些细菌菌株，如丙酸杆菌，梭状芽孢杆菌，和乳杆菌具有的共轭亚油酸（不同的生物合成的能力）。在KEGG途径富集分析中，我们确定了受到WSSV攻击的虾肠中不饱和脂肪酸的生物合成途径。我们还确定了细菌的菌株虾肠中的链球菌和梭状芽胞杆菌，这些细菌菌株可能是虾肠中亚油酸增加的原因。研究表明，亚油酸对人类具有重大的健康促进作用，迄今为止，至少有人提出了其功能的两种机制理论：内质途径和核途径。在核途径中，亚油酸充当增殖物激活受体的配体，而增殖物激活受体的配体激活的转录因子诱导靶基因的表达。我们检测了包括DORSAL和RELISH在内的NF-κB样转录因子的表达和核易位，以分析该酸在虾中的可能抗病毒机制。我们发现亚油酸可以促进DORSAL和RELISH在虾中的表达和核转化，并且发现亚油酸能促进感染WSSV的对虾DORSAL和RELISH的表达和核转化。我们还检测了虾肠道中某些Aps的表达，结果表明，饲喂亚油酸后，Alf-b1，Alf-c1，Alf-c2和Alf-d2的表达显着增加。同时，我们发现Vago5是虾中亚油酸处理后一种明显增加的IFN样蛋白。先前的研究报道Vago5是DORSAL的靶基因，并参与了虾对WSSV的先天免疫。所有这些结果表明，亚油酸可以激活NF-κB通路并诱导一系列Aps和IFN样Vago5的表达来抵抗虾的病毒感染。我们还探索了亚油酸对NF-κB途径的激活。先前的研究表明，ERK可以调节HUVEC中NF-κB的活性。研究者在日本支原体中已发现ERK ，它影响了NF-κB样转录因子（DORSAL）的磷酸化。我们的研究表明，亚油酸可以促进WSSV感染后ERK的磷酸化，表明亚油酸可以激活ERK来磷酸化DORSAL和RELISH，并导致它们转化为虾肠中的核。除了激活针对虾中WSSV感染的NF-κB途径外，我们还发现亚油酸可以直接抑制WSSV的复制。最新研究表明，亚油酸可与SARS-CoV-2的突触蛋白结合并抑制病毒复制。在我们的研究中，我们使用WSSV亚油酸的混合物感染昆虫Sf9，并检测了WSSV Ie1和Vp28的表达。结果表明，亚油酸处理后Ie1和Vp28的表达显着降低，表明亚油酸可能直接与WSSV相互作用并抑制病毒进入细胞和/或病毒复制。综上所述，我们建立了虾WSSV口腔感染的方法，并分析了虾WSWS感染后虾肠道菌群的代谢产物，总共发现了78种不同的代谢产物和5种不同的代谢途径。其中，WSSV感染后肠道中的亚油酸显着增加。亚油酸可能直接与WSSV结合并阻止病毒进入细胞和/或病毒复制。相反，亚油酸通过激活虾中的ERK-NF-κB途径来促进针对WSSV感染的AP和Vago5的表达（图9）。我们的结果表明，WSSV感染导致了代谢组学谱的变化，代谢产物亚油酸促进了虾对WSSV感染的免疫反应。这项研究确定了虾肠中的代谢产物亚油酸，并且据我们所知，为虾养殖中病毒预防和控制的饲料添加剂提供了新的候选者。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33863791/

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